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方柏山课题组建立基于适配体无细胞的靶蛋白检测系统|SSB

发布时间2021-08-21

自然界已经进化出了各种各样的蛋白质以维持生命活动的生理功能,而某些具有确切功能的蛋白质的量可能预示着疾病的进程。这样的蛋白质可被归类为生物标志物(biomarker)而作为疾病诊断和治疗的靶标。在复杂样品中检测某一特定的蛋白质,通常可使用分离分析和结合测试的方法。分离分析方法经常需要能够实现高通量测试的昂贵的仪器设备,而结合测试则经常使用诸如抗体之类的识别分子进行检测。由于针对特殊蛋白的抗体较为昂贵、热稳定性差且不易修饰和扩增,近年来,适配体(aptamer)这种特殊的功能性核酸(functional nucleic acids)逐渐受到了研究人员的青睐。针对特定靶标的适配体可通过指数富集的配体进化技术(SELEX)筛选得到,其特异性与抗体相当,但热稳定性、可修饰性及扩增性均是抗体所不能比拟的。得益于此,以适配体为代表的基于功能性核酸的生化分析策略得到了充分的发展。


而来源于细菌防御系统的CRISPR/Cas系统,尤其是CRISPR-Cas12a、Cas13a、Cas14以及Csm6等具有核酸酶活性的效应蛋白,则具有可用于核酸检测的稳健性能。这些Cas蛋白在识别靶标核酸之后,可触发非特异性切割核酸的活性(即反式切割活性),因此可使用带有猝灭基团-荧光基团修饰的短链核酸作为报告分子和信号放大的底物。


近日,厦门大学方柏山课题组在Synthetic and Systems Biotechnology发表文章,基于CRISPR-Cas12a的反式切割活性,课题组发展了一种以“竞争”反应为核心的检测靶标蛋白的方法——ABCD系统(Aptamer Based Cell-free Detection system)。其主要原理如图1所示。适配体及与其部分互补的互补链(complementary strand)形成的双链结构首先被固定于固相载体上,当体系中存在靶标蛋白时,靶标蛋白与适配体结合从而释放互补链(即“竞争”);被释放的互补链随即作为Cas12a-crRNA复合物的靶标并激活Cas12a的反式切割活性,从而使得报告分子被切断而释放出可被检测的荧光。


图1. ABCD系统的原理

以检测泛肿瘤标志物人上皮细胞粘附分子(EpCAM)为例,研究人员分别证明了适配体-互补链复合物可以稳定存在、EpCAM可以“竞争”过互补链从而使互补链释放、互补链可以激活CRISPR-Cas12a并触发其反式切割活性。随后,研究人员对于系统的整体性能进行了表征(图2),并证明了ABCD系统可检测较低浓度范围的EpCAM(50-100 nM)。研究人员对“竞争”反应的可行性进行了研究,并对适配体与其互补链间互补的碱基个数进行了探索。通过比较双链复合物与适配体-靶标蛋白复合物的解离常数Kd,研究人员确定了可行的互补碱基个数。通过对该流程进行整合,研究人员定义了ABkey函数,以便普适化ABCD系统进行靶标蛋白的检测


虽然ABCD系统的检测灵敏度还不算太高,但是相比于传统的ELISA方法,其具有稳定性高、操作简便和检测快速的优势。在未来的工作中,可以使用CONAN系统(Sci Adv 2021;7(5):eabc7802)或延伸crRNA(Nat Commun 2020;11(1):4906)的方法进一步提高ABCD系统检测的灵敏度。除此之外,由于使用了固相载体,ABCD系统具有进一步发展成相应的便携式检测仪器的潜力(例如使用微流控芯片等)。


图2. ABCD系统的完整检测流程。(A)用于EpCAM检测的ABCD系统的操作流程。(B)使用不同摩尔的EpCAM测试ABCD系统的性能。

文章信息

Aptamer-based cell-free detection system to detect target protein

Junhong Chen, Xiaoyan Zhuang, Jiyang Zheng, Ruofan Yang, Fei Wu, Aihui Zhang, Baishan Fang

Volume 6, Issue 3, September 2021, Pages 209-215


关于作者



通讯作者:方柏山,厦门大学化学化工学院教授、博士生导师,闽江学者特聘教授。研究方向为合成生物学与生物分子机器、定向进化与生物催化、生物技术过程开发与优化等。担任中国微生物学会生化过程模型化与优化专业委员会副主任、中国生物化学与分子生物学学会工业生物化学与分子生物学分会常务理事等职务。主持国家自然科学基金重点项目、国家自然基金、国家海洋局海洋公益性行业科研专项等国家级项目10余项,在国内外具有影响力的期刊上发表论文百余篇,授权专利20余项;荣获全国优秀教师等称号。


关于期刊


Synthetic and Systems Biotechnology 是由科爱出版的高质量国际开放获取期刊,创刊于2016年。该期刊覆盖合成生物学、系统生物学以及生物医药等领域的各个方面。


  • 本刊现已被SCIE、EMBASE、PubMed Central、Scopus等数据库收录。

  • 2021年获得第一个影响因子:4.708,Q1区

  • 2020CiteScore: 8.4,学科领域排名14/113

  • 本刊入选2019年中国科技期刊卓越行动计划高起点新刊项目。

  • 本刊是中国生物工程学会合成生物学专业委员会的会刊。

  • 本刊是生物反应器工程国家重点实验室的官方期刊。


图文来源:“科爱出版”微信公众号

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